Прикарманившие эволюцию

Что мы знаем о Нобелевских лауреатах по химии 2018 года? Их трое (но это могли бы быть другие люди). Все они — скорее биологи. Они работали по отдельности, но каждый взял на себя роль творца: заставил бактерий производить интересующие его белки, раз за разом отбирая лучшие варианты. Теперь нам известно, кто двигает современную эволюцию (по крайней мере, на молекулярном уровне): их зовут Фрэнсис Арнольд, Джордж Смит и Грегори Уинтер.

Эта история началась более 30 лет назад. Мобильные телефоны были редкостью, геном человека еще не начали секвенировать, а о CRISPR, и уж тем более Cas, никто не слышал. Молекулярная биология была совсем не похожа на то, что мы видим в современных лабораториях. Ученые искали способ создавать усовершенствованные белки с новыми свойствами. Можно, конечно, попробовать собрать белок с нуля, но велик шанс промахнуться и новых свойств не получить. Тогда появилась беспроигрышная идея: использовать проверенный механизм адаптации молекул к новым условиям — эволюцию. 

Это сейчас, оглядываясь назад, мы можем говорить о том, что эти люди применили принципы живых систем к неживым и продвинули нас на пути к созданию искусственной жизни.

А тогда они всего лишь решали конкретные задачи: пытались разобраться во взаимодействии ДНК и белков, хотели создать биоразлагаемое топливо или новое лекарство, и едва ли могли предположить, что на их примере мы через много лет напишем инструкцию для начинающих творцов, решивших оседлать эволюционный процесс.

С чего начать

Лучше всего — с профильного образования, как это сделали Джордж Смит и Грегори Уинтер, которые как решили в молодости заняться биологией, так всю свою жизнь ей и занимаются.

Но есть и обходные пути, как показывает невероятная история Фрэнсис Арнольд. Казалось, Арнольд сделала все, чтобы не стать не то что биологом, а ученым вообще: сбегала с уроков на протестные акции против войны во Вьетнаме, ушла из дома, еще оставаясь ученицей старших классов (а на жизнь зарабатывала, работая барменшей и таксисткой), несмотря на это все-таки поступила в Принстон — на факультет механики и аэрокосмической инженерии (потому что на него было проще всего поступить), бросила учебу на год, чтобы переехать в Италию и там работать на фабрике по производству ядерных реакторов, заявив, что не собирается больше заниматься наукой. Но у судьбы были на нее другие планы.

На дворе 70-е: цены на нефть растут, в США самый тяжелый кризис со времен Великой депрессии, Картер учреждает министерство энергетики, устанавливает солнечные панели на Белый дом и заявляет, что к концу века американцы должны слезть с нефтяной иглы. Ученые и инженеры отзываются на этот призыв, и Арнольд, только что защитившая диплом инженера, оказывается среди них — занимается солнечными панелями, и сегодня грустью вспоминает о цели довести до 20% долю возобновляемых источников энергии в США к 2000-му году. Картер уходит, на его место приходит Рейган, на солнечные панели смотрят, как на странную причуду непопулярного президента, и Фрэнсис приходится искать себе новое дело. Но идею «зеленых» инноваций она уже не бросит.

Ее дальнейший путь ведет в Беркли, где она получает степень магистра химической инженерии. После этого, где она, не желая иметь ничего общего с нефтяной индустрией, пытается заниматься «рациональным» дизайном новых соединений в Калтехе, ищет ферменты, которые позволили бы сделать процесс получения энергии менее токсичным. Но быстро разочаровывается в возможностях человеческого разума в сравнении с природой («Вы тратите два года, у вас ничего не выходит, вы начинаете с начала») — и понимает, что надо перенимать технику у той, кто справляется с задачей лучше.

«25 лет назад это (белковая инженерия методами направленной эволюции) считалось безумием. Ученые подобным не занимались, джентельмены подобным не занимались. Но, поскольку я инженер и не джентельмен, меня это не заботило», — вспоминает она.

Бесконечный конвеер

Итак, мы хотим получить нужный нам биологический объект так же, как это делает природа. Чтобы запустить эволюционный процесс, вам нужны три компонента: (1) объект отбора, (2) фактор, создающий разнообразие, и (3) сила, осуществляющая отбор. В качестве объекта во всех нобелевских исследованиях выступали белки. Значит, кто-то должен был их производить в больших количествах. Это теперь мы умеем синтезировать белки без помощи клеток, а тогда требовался живой организм.

На помощь пришли бактерии: они быстро размножаются, и в их ДНК несложно встроить нужный ген (в отличие от клеток человека или мыши, ДНК которых защищена ядром). В то время это уже умели делать. Кроме того, бактерии могут служить домом для вирусов — бактериофагов, чья ДНК устроена еще проще. Она небольшого размера и легко поддается манипуляциям, а нужные белки впоследствии сами «выпрыгивают» в руки экспериментатора, когда вирусные частицы покидают зараженную клетку.

Дежурный по разнообразию

Следующая задача — создать разнообразие белков, чтобы эволюции местного значения было, из чего выбрать. Для этого нужно внести в ДНК исходного белка разные мутации, чтобы в итоге получились немного отличающиеся друг от друга белки. Дальше можно будет сравнивать их форму и свойства, и отбирать те, что нам больше подходят — иными словами, заниматься самой обыкновенной селекцией. Однако чтобы этот метод работал, необходимо, чтобы исходный белок уже проявлял нужные способности, пусть даже совсем слабо. Если же наш белок на старте совсем не умеет того, что мы от него хотим, шансов добиться этого с помощью мутаций практически нет.

С этой проблемой столкнулась группа Арнольд, которая как раз занималась выведением белков со специальными свойствами. Например таких, которые умеют производить топливо в безвоздушном пространстве — на их основе можно делать более экологичное топливо. Или таких, которые могут активироваться под действием света — их можно было бы потом встраивать в клетки мозга и избирательно активировать эти клетки световыми лучами. Поэтому существенной частью ее работы стал поиск белков, которые обладали бы нужной активностью, хотя бы на минимальном уровне.

После того, как подходящий белок найден, необходимо внести мутации в ген, который его кодирует. Для этого нужно определить ту область белка, которую мы хотим изменить. Это может быть активный центр, если мы говорим о ферменте, или центр связывания с другим белком, если необходимо произвести антитело. Затем мы определяем, какая часть ДНК белка отвечает за эту область. И, наконец, доверяем копирование этой части нарочно неряшливой полимеразе — она переписывает ДНК быстро и с ошибками много раз подряд. Получается целый набор вариантов для тестирования.

Есть и еще один способ создать много мутантных копий ДНК — так называемая «перетасовка» (DNA shuffling). Автор этого метода — Уильям Стеммер — мог бы заменить кого-то в сегодняшнем комплекте лауреатов, но на 5 лет не дожил до мирового признания. Его идея состояла в том, чтобы рекомбинировать, то есть перетасовывать ДНК, кодирующие один и тот же белок у разных бактерий. Такой своеобразный секс в пробирке позволяет собирать еще более разнообразные варианты белков — отличный материал для эволюции.

Результат налицо

В то время как Арнольд выращивала белки в бактериях, чтобы получить нужные соединения для ученых и инженеров, Джордж Смит решал другую задачу. Ему нужно было определить функцию множества неопознанных генов, соотнести их с белками. И он придумал использовать для этого бактериофагов.

Смит встраивал ген интересующего его белка в ДНК бактериофага, рядом с геном, кодирующим белок его оболочки. В результате белки оболочки вируса получались с довеском в виде исследуемого белка. И когда вирусные частицы отпочковывались из клетки, закончив там свои темные дела. Дальше можно было обрабатывать бактериофагов, например, антителами и смотреть, какие из них будут связываться с белками, выведенными на «борт» вирусов. Этот метод Смит назвал фаговым дисплеем, потому что оболочка бактериофага работает как дисплей, демонстрирующий вшитые в него белки.

Кто отберет лучших

Каждый из нобелевских лауреатов вершил свой суд по-разному. Арнольд отбирала белки, которые лучше других вступали в интересующие ее реакции. Смит занимался опознанием прежде неизвестных генов методом дисплея. А Грегори Уинтер, третий сегодняшний лауреат, взял фаговый дисплей Смита и сделал все наоборот: вместо того, чтобы отбирать белки с помощью антител, он взялся отбирать антитела с помощью белков.

Он вводил в геном бактериофагов последовательность ДНК, кодирующую чувствительный кончик антитела (антиген-связывающую область). В результате вирусы оказывались покрыты фрагментами антител. Затем он обрабатывал их белком и отбирал те, которые связывались лучше. В результате у Уинтера получилась система эволюции антител в пробирке.

Что сотворили

Три нобелевских лауреата преследовали разные цели и пользовались разными технологиями, но так или иначе научились решать главную задачу — совершенствовать белки. Дальше этот метод можно применять в любой области, как внутри биологии, так и за ее пределами. Поэтому, например, Арнольд удалось внести свой вклад в самые разные отрасли технологии: она «помогла» эволюционировать множеству белков, участвующих в реакциях органического синтеза, научила кишечную палочку производить каротиноиды и необычные аминокислоты, основала свою компанию по производству биотоплива и даже придумала более дешевый способ синтеза лекарства от диабета.

Метод Смита в исполнении Уинтера оказался полезен для разработки лекарств на основе антител. Чем точнее и прочнее антитело связывается со своей мишенью, тем лучше оно может заблокировать целевую молекулу. Удачным вариантом применения суперточных антител оказался препарат адалимумаб, который блокирует фактор некроза опухоли — мембранную молекулу, с помощью которой Т-лимфоциты посылают сигналы гибели другим клеткам. Снижая активность Т-лимфоцитов, можно бороться с аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, псориаз и другие (нельзя не вспомнить, что два дня назад Нобелевскую премию по биологии и медицине присудили за разработку препаратов со строго противоположным эффектом). На данный момент существуют еще пять лекарств на основе антител, разработанных с помощью фагового дисплея — против системной красной волчанки, сибирской язвы, макулодистрофии и двух видов рака.

Таким образом, Нобелевский приз этого года распределился в следующем соотношении: половина — за концепцию рукотворной эволюции молекул, четверть — за удобную методику, и еще четверть — за практическое применение удобной методики, приведшее к появлению эффективных лекарств.

***

На пресс-конференции члены нобелевского комитета отметили, что премия по химии в этом году получилась необычной — в том смысле, что получилась не то, чтобы премией по химии. Тем не менее, после присуждения половины премии по физике полезное для биотехнологий изобретение уже можно было предположить, что и химия на этот раз окажется замаскированной биологией. Тем временем впереди еще премия по экономике и премия мира, и кто знает — вдруг победное шествие биологов еще не закончилось?

Полина Лосева