Несколько лет назад сибирские исследователи начали успешно замораживать эмбрионы кошачьих, а также научились изучать фазовые переходы липидов и изменения в клеточном дыхании при низких температурах. Сегодня ученые Института автоматики и электрометрии СО РАН и ФИЦ «Институт цитологии и генетики СО РАН» продолжают изучать процессы, протекающие при низкотемпературном охлаждении клеток и совершенствовать методы криоконсервации. Последние исследования расширяют знания о том, как меняется метаболизм замораживаемых эмбрионов, почему липиды приводят к гибели клеток при криоконсервации и от чего зависит оптимальный режим охлаждения. Результаты работ опубликованы в журнале Biophysical Journal.
Криконсервация уже давно стала обычной биомедицинской практикой. Низкие температуры помогают сохранять ткани, сперматозоиды, яйцеклетки и даже состоящие из нескольких клеток ранние эмбрионы. Криоконсервировать человеческий биоматериал оказалось достаточно легко, но заморозка генетического материала млекопитающих, составляющих дикую фауну, в том числе редких и исчезающих видов животных, практикуется гораздо реже и успехи в этой области достаточно скромные. Отогретый после криоконсервации генетический материал может быть использован для восстановления популяций таких животных.
Клетки млекопитающих функционируют в очень узком температурном диапазоне. Несмотря на это, криогенные температуры сами по себе не приводят к повреждениям клеток, так как при этих температурах все процессы в клетках останавливаются. Повреждения, связанные с воздействием холода, в большинстве случаев — результат изменений, протекающих в ходе охлаждения и отогрева биологических объектов. В идеале хотелось бы заморозить все молекулы моментально, как бы остановив биологические часы, и затем в нужное время их включить. Следовательно, успешное сохранение и восстановление клеток во многом зависит от способности контролировать процессы охлаждения и разогрева. Одна из главных задач криоконсервации — поддержание оптимальных условий для переходов между физиологическими условиями и состоянием анабиоза.
Сегодня практикуются два подхода к криоконсервации. Способ программного замораживания путем медленного охлаждения, управляемого образования льда в безопасных для замораживаемых клеток местах криоконтейнера и постепенного обезвоживания минимизирует вероятность кристаллизации внутри клеток. Эта технология требует подбора конкретных протоколов, учитывающих специфичность клеток разных организмов. Основные трудности при охлаждении связаны с фазовыми переходами, которые способны коренным образом поменять клеточную среду. Например, если образец охлаждается слишком быстро, то вода не успеет покинуть клетку и кристаллизуется, образовавшийся в результате этого лед может повредить ее структуру. Необратимые повреждения клеток, но уже по другим причинам, могут произойти при слишком медленном разогреве замороженного образца. Поэтому внимание исследователей зачастую сфокусировано на предотвращении различных криоповреждений, природа многих из них до сих пор недостаточно изучена. Программное замораживание может быть использовано для криоконсервации клеточных суспензий, например сперматозоидов, а также ооцитов и преимплантационных эмбрионов.
В настоящее время альтернативным методом криоконсервации одиночных клеток и эмбрионов является витрификация. Идея этого способа заключается в добавлении высоких концентраций криопротекторов и максимально быстром (в идеале моментальном) охлаждении до температур жидкого азота. Высокая кинетика охлаждения позволяет избежать образования льда и снизить вероятность некоторых других повреждений.
Однако не все виды млекопитающих сохраняются одинаково хорошо. Не составляет труда разморозить эмбрион мыши, тогда как процент выживаемости после криоконсервации эмбрионов свиньи, если не прибегать к специальным ухищрениям, оказывается очень низким или даже нулевым. Как выяснилось, на успешность процесса криоконсервации и разморозки влияет наличие липидных гранул. Когда в одном из исследований из клеток эмбриона свиньи механическим путем удалили липиды, выживаемость увеличилась почти до 40 %. В то же время эти жирные кислоты необходимы для клеточного метаболизма, а делипидирование оказывает негативное влияние на дальнейшее развитие эмбриона. Возникает закономерный вопрос о том, что же все-таки происходит в ходе охлаждения и отогрева с липидными гранулами такое, что приводит к гибели клеток?
«Криоконсервация зависит от множества физических эффектов, на чем и основано наше сотрудничество с ФИЦ “Институт цитологии и генетики СО РАН”, — рассказал старший научный сотрудник лаборатории спектроскопии конденсированных сред кандидат физико-математических наук Константин Александрович Окотруб. — Для физика здесь особенно интересны температуры фазовых переходов, изменения свойств образующих клетки материалов, в частности их упругие свойства и вязкость. Именно физические свойства лежат в основе изменений, происходящих с клетками при криоконсервации. Даже при витрификации, когда используются предельно высокие скорости охлаждения, молекулы успевают перемещаться, белки и липиды успевают менять конформационные состояния».
Ключевую роль в клетках при криоконсервации выполняют липиды — строительный материал клеточных мембран и энергетический ресурс для развития зародыша. В состав липидов входят жирные кислоты с углеводородными цепочками, обладающими одиночными и двойными связями. В зависимости от количества двойных связей их различают по степени ненасыщенности, которая, в свою очередь, определяет физические и биологические свойства липидов. Различают разные конформационные состояния углеводородных цепочек: упорядоченные, когда вся цепочка вытянута, и разупорядоченные. Изначально при физиологических условиях все липидные гранулы в клетке находятся во флюидном (или, другими словами, жидком) состоянии, а углеродные цепочки разупорядочены. При криоконсервации липиды претерпевают фазовый переход, при котором они переходят в упорядоченное конформационное состояние.
Сотрудникам сектора криоконсервации и репродуктивных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН под руководством доктора биологических наук Сергея Яковлевича Амстиславского удалось показать, что на успешность криоконсервации влияет не только количество липидов, но и степень их насыщенности. Наглядным модельным объектом для таких исследований стали кошачьи эмбрионы, ведь они богаты липидами, которые очень чувствительны к охлаждению. Если посмотреть на них через свет, они будут темными, тогда как, например, эмбрионы крыс и мышей — светлые: липидных гранул в них очень мало.
Чтобы изучить происходящие внутри замораживаемых клеток фазовые переходы, ученые использовали спектроскопию комбинационного рассеивания света (КРС) меченных изотопами молекул, позволяющую изучать молекулярные колебания по рассеянию лазерного излучения. При замене водорода на дейтерий меняются частоты колебаний, что хорошо видно в спектрах КРС и позволяет независимо изучать состояние меченых и немеченых. С помощью соответствующих изотопных меток на молекулах можно фиксировать поглощение липидов и химические превращения. Исследователи научились вводить жирные кислоты и модифицировать их состав, примешивая различные липиды, чтобы отслеживать определенную фракцию. «Мы примешивали дейтерированные жирные кислоты разной степени насыщенности, что позволило изучать различные фракции, не добавляя флуоресцентные метки, которые повлияли бы на свойства гранул, — сказал Константин Окотруб. — Так, при дейтерировании масса водородов увеличивается в два раза, а частота их колебаний в молекуле уменьшается. В одной части спектра видны старые липиды, а во второй — привнесенные нами. Таким образом, мы можем наблюдать фазовые состояния тех и других, а с помощью картирования изучать пространственное распределение».
«На ооцитах (женские половые клетки, участвующие в размножении. — Прим. ред.) домашней кошки нам удалось показать, что разные липиды в составе липидных гранул претерпевают фазовый переход в упорядоченное состояние по-разному, — объяснил Константин Окотруб. — Насыщенные липиды переходят в упорядоченное состояние раньше ненасыщенных, при этом происходит пространственное разделение липидных фракций по степени ненасыщенности. Насыщенные располагаются вблизи поверхности липидных гранул, а ненасыщенные оказываются внутри. Меняются свойства на поверхности липидных гранул, поэтому различные липиды переходят в упорядоченное состояние неодновременно. Более того, как оказалось, не все липиды возвращаются в исходное состояние после разморозки. Часть насыщенных липидов может оставаться в упорядоченной замороженной фазе даже после отогрева до температур, превышающих физиологические. Мы полагаем, что наблюдаемое перераспределение липидов и их неполное восстановление в жидкую фазу становится одной из причин гибели при замораживании ооцитов и эмбрионов, богатых липидными гранулами».
Помимо изменений, происходящих непосредственно в процессе криоконсервации, комбинационное рассеяние света изотопических меток позволяет изучать влияние криоконсервации на клеточный метаболизм. Эта методика дает возможность увидеть, как меняются помеченные соединения при их попадании в клетку в процессе катаболизма и усвоения. В некоторых случаях это даже позволяет определить, на какие конкретные продукты распалось соединение. Чтобы изучить влияние криоконсервации на дальнейшее развитие эмбрионов, ученые отслеживали поглощение дейтериновой стеариновой кислоты эмбрионами мышей. Оказалось, как программное замораживание, так и витрификация приводят к увеличенному поглощению жирных кислот, что указывает на усиление липидного метаболизма в эмбрионах после криоконсервации по сравнению с эмбрионами, не подвергавшимися низкотемпературному охлаждению.
Подробное изучение процесса изменений клеток при криоконсервации поможет подобрать оптимальные режимы замораживания для эмбрионов разных видов. Ученые надеются, что в перспективе смогут сохранять и восстанавливать генетический материал всех видов млекопитающих для сохранения дикой природы. Ведь техника криоконсервации эмбрионов и гамет диких кошачьих принципиально такая же, как и у домашней кошки, что было показано в работе С. Я. Амстиславского, Евгения Юрьевича Брусенцева и других сотрудников сектора криоконсервации и репродуктивных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН, когда отработанный на сперматозоидах домашнего кота протокол криоконсервации был успешно применен к дальневосточному лесному коту. Результаты работ опубликованы в журнале Reproduction in Domestic Animals.
Чтобы в будущем иметь хорошую технологию сохранения генетических ресурсов диких представителей семейства кошачьих, а также, чтобы понять роль липидов при криоконсервации репродуктивных клеток, коллектив исследователей из двух институтов СО РАН, состоящий из физиков и биологов, проводит криогенные исследования на модельных объектах. Это, прежде всего, эмбрионы мыши, получаемые в виварии ФИЦ ИЦиГ СО РАН, и эмбрионы домашней кошки, получаемые с помощью ЭКО в секторе криоконсервации и репродуктивных технологий СО РАН из биоматериалов, которые обычно выбрасываются при стерилизации котов и кошек. Используется органический материал (яичники для получения ооцитов и эпидидимисы для получения сперматозоидов), поэтому, как подтвердили ученые, ни одна кошка и ни один котик в ходе исследований не пострадали.
Глеб Сегеда
Фото автора
- Войдите или зарегистрируйтесь, чтобы отправлять комментарии