Чем разрезать ДНК

Появление «молекулярных ножниц» – системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 – привело к бурному всплеску генетических технологий. Впервые особый локус CRISPR у бактерий обнаружила группа японских ученых еще в 1987-м. Понадобилось более 20 лет, чтобы разработать искусственную систему CRISPR, дополненную белками Cas, для направленного редактирования генома. За внедрение новых методов генетической инженерии в 2020 году получили Нобелевскую премию по химии Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье. Однако, как и во время любой революции, за кадром осталось много вопросов, требующих пристального изучения.

“Мы отдельно говорим о системах репарации ДНК и системах геномного редактирования. Но любые инструменты геномного редактирования сначала повреждают ДНК. Как себя при этом ведут системы репарации, прекрасно развитые в организме? Между двумя этими системами – «черный ящик», о событиях в котором ученым ничего не известно. Словом, интригующих идей для проверки было много”, – рассказывает директор Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН член-корреспондент РАН Дмитрий Пышный.

Начать настоящие поисковые исследования, не имеющие аналогов в мире, коллективу ИХБФМ СО РАН позволил грант Российского научного фонда. Проект «Модификация нуклеиновых кислот и репарация ДНК как источник новых инструментов управления геномами» помимо научной новизны отличается удивительной многоплановостью.

– В институте сложились несколько научных школ, направленных на исследование процессов репарации ДНК. Это школы Ольги Ивановны Лаврик, Дмитрия Олеговича Жаркова. Отличными компетенциями с точки зрения физико-химического анализа белково-нуклеиновых взаимодействий обладает группа Никиты Александровича Кузнецова, – продолжает руководитель проекта Дмитрй Пышный. – Помимо взаимодействия систем репарации и геномного редактирования мы решили исследовать, к чему приведет модификация нуклеиновых кислот, которые помогают CRISPR/Cas распознавать нужный ген. Хотя это и не очень афишируется, но генетики знают: молекулярная машина, вносящая изменения в геном, работает не всегда корректно. И проблема повышения точности – одна из самых наболевших. Сбалансированные усилия химиков и энзимологов (энзимология – наука о ферментах) могут ее решить с помощью модификации РНК-проводников, которые как раз отвечают за узнавание нужного участка. К тому же группа Никиты Кузнецова планирует освоить синтез довольно длинных одноцепочечных нуклеиновых кислот для создания новых генетических конструкций. Одновременно мы хотим попытаться по-другому выстроить систему редактирования, возможно, создать новые молекулярные машины, способные распознавать участки ДНК и вносить направленные изменения в структуру генома. Грант рассчитан на 4 года, думаю, за это время нам удастся создать какие-то гибридные молекулы для геномного редактирования, которые несут в себе блоки и домены разных природных объектов.

«Цинковые пальцы» и «молекулярные ножницы»

– Генетические технологии родились на рубеже 1970-х и 1980-х годов, когда биологи научились точно перемещать фрагменты ДНК из одного места в другое. Параллельно благодаря развитию химии синтеза олигонуклеотидов стали получать участки ДНК необходимой последовательности, – рассказывает заведующий лабораторией геномной и белковой инженерии ИХБФМ СО РАН член-корреспондент РАН Дмитрий Жарков. – Сейчас под генетическими технологиями подразумевается изменение генетического материала непосредственно в живых клетках. Первые инструменты для этого появились еще в 1980-х годах: были открыты белки класса «цинковых пальцев», способные узнавать определенные последовательности ДНК. Затем ученые обнаружили у бактерий, вызывающих болезни растений, белки класса TALE, которые также узнают нужные последовательности в геноме хозяина и меняют активность генов. Однако эти инструменты были не очень удобными для геномной инженерии: на каждую последовательность, которую мы хотели изменить, приходилось синтезировать новый белок. Поэтому статьи о том, что благодаря новой системе CRISPR/Cas можно специфически узнавать участок ДНК с помощью небольшой молекулы РНК и вносить разрывы непосредственно в геном клеток человека, вызвали фурор среди генетиков. Произошла настоящая научная революция: появился универсальный небольшой и просто синтезируемый инструмент. Это можно считать началом современного бума генетических технологий. С помощью направленной РНК мы вносим разрыв в нужное место ДНК, в этот разрыв можно либо встраивать требуемые фрагменты ДНК, либо выключать какие-то гены при обратном сшивании с мутацией.

Появилось много примеров применения системы, начиная с нашумевшей и этически неоднозначной работы китайского ученого Хэ Цзянькуя по редактированию генома девочек-близнецов еще на стадии эмбриона и заканчивая созданием породы свиней, устойчивых к африканской чуме. Но какие бы прекрасные отзывы ни поступали о новом инструменте, к его использованию в медицине по-прежнему есть существенные препятствия.

Дело в том, что все известные на сегодняшний день системы геномного редактирования обладают определенной нецелевой активностью. И если мы можем закрыть глаза на то, что вновь выведенный сорт кукурузы будет нести какие-то дополнительные мутации, отличные от запрограммированных, то совершенно недопустимо, чтобы такие мутации возникали в ДНК пациентов при геномной терапии. А единственный способ проверки на сегодняшний день – глубокое секвенирование генома, что очень дорого и не годится для массового применения. Ученые всего мира сегодня работают в двух направлениях. Во-первых, пытаются модифицировать активный модуль, чтобы придать системе CRISPR/Cas новые функции. Во-вторых, стараются повысить точность работы системы и избежать изменений в других фрагментах ДНК. Подходы к этому могут быть самые разные. В частности, явно недостаточно исследован такой: менять не сам белок, а химическую структуру нуклеиновой кислоты, которая с ним связана. Возможно, модифицируя нуклеиновые кислоты, нам удастся повысить точность геномного редактирования. Учитывая, что в нашем институте самая сильная в России нуклеотидная химия, неудивительно, что было решено попытаться это сделать в рамках проекта РНФ.

С хирургической точностью

Классические методы генетической инженерии подразумевают, что исследователь использует биоматериал, содержащий геномную ДНК или мРНК, и с помощью хорошо описанных процедур клонирует целевой ген, с которым работает дальше. Это достаточно легко сделать, если речь идет о человеке или мыши. А как быть с организмами экзотическими или теми, которые уже не существуют?

– Проблема получения биологического материала, содержащего ДНК такого организма, крайне сложна, – комментирует заведующий лабораторией генетических технологий ИХБФМ СО РАН доктор химических наук Никита Кузнецов. – Именно поэтому актуально наше направление проекта синтез протяженных олигонуклеотидов с целью их дальнейшего применения в новых подходах к созданию генов.

Сегодня олигонуклеотиды синтезируют химическим способом, имеющим ограничения по длине синтезируемого фрагмента. Ферментативный метод синтеза олигонуклеотидов, который мы разрабатываем, позволит в разы увеличить длину синтетических фрагментов ДНК. Для этой цели мы используем один из ферментов человека – терминальную дезоксирибонуклеотидилтрансферазу, способную присоединять нуклеотиды к любому доступному 3′-концевому фрагменту ДНК. Однако в организме присоединение нуклеотидов происходит случайным образом. Мы планируем заставить фермент работать так, чтобы олигонуклеотиды присоединялись в определенной, заданной исследователем последовательности. Для этого нужно после каждого присоединения останавливать работу фермента с помощью модифицированных нуклеозидтрифосфатов. В нашем институте был предложен вариант модификации нуклеозидтрифосфата, никогда в мире не применявшийся для такого типа реакций с ферментами. Этот подход мы и тестировали в первый год работы над проектом. По химической части продвижение очень серьезное. Но было установлено, что природный фермент оказался слишком «нежным» для работы: плохо переносит высокие температуры, быстро инактивируется. Поэтому наша задача в ближайшее время связана с получением высокоактивного устойчивого к температурному воздействию фермента. Используем два взаимодополняющих подхода. Во-первых, путем молекулярного моделирования проверяем десятки вариантов мутантных форм фермента человека, которые могут обладать нужными свойствами. Отобранные таким способом варианты будут получены методами сайт-направленного мутагенеза и затем проверены в реальных условиях. Во-вторых, ищем в природе похожий по свойствам, но устойчивый к высоким температурам фермент. Например, как у бактерий, живущих в гейзерах или горячих источниках. В этом направлении идет активная работа. Кстати, данный фермент применяется в некоторых тест-системах, направленных на изу-чение воздействия различных веществ на ДНК. И, запуская ферментативный синтез протяженных фрагментов ДНК, мы параллельно способствуем развитию диагностических систем.

– Недаром даже в названии проекта звучит «создание новых инструментов», – подчеркивает Дмитрий Пышный. – Основной интерес мы видим в применении этих инструментов для геномного редактирования, но их можно использовать и в других областях. Как отвертку, образно говоря. Нуклеиновая кислота – универсальный объект молекулярной биологии. И инструменты, методы, алгоритмы, ферменты, нами созданные, должны широко применяться. Когда мы говорим о биотехнологической части проекта, необходимо детально изучить сам процесс работы фермента, чтобы понять, как можно ее оптимизировать.

– В 2021 году благодаря средствам гранта мы купили прибор для изучения быстропротекающих ферментативных процессов Quench-flow RQF-3 (KinTek Corp., USA) – он позволяет останавливать ферментативную реакцию в нужный момент времени, начиная с 5 миллисекунд после старта. Детальное изучение механизма действия фермента требует такой специфической техники, – добавляет Никита Кузнецов.

Искусственное вне конкуренции?

Внесение любых изменений в геном живого организма сопровождается включением систем репарации ДНК, отвечающих за стабильность, сохранность, целостность генетической информации. В основу проекта легла простая идея: посмотреть in vitro и in vivo, как система геномного редактирования CRISPR/Cas конкурирует с имеющимися в клетке системами репарации, работающими, кстати, чрезвычайно эффективно.

– CRISPR/Cas – искусственная система, она вносит специфические мутации в геном. И системы репарации, которые состоят из ансамблей белков, вроде бы должны ей мешать работать. Эту гипотезу обязательно нужно проверить во избежание возможных сложностей для направленного воздействия системы СRISPR/Cas, – поясняет заведующая лабораторией биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН академик Ольга Лаврик. – В нашей лаборатории исследуются соответствующие белки репарации, которые в клетке очень эффективно взаимодействуют с разрывами ДНК, – ДНК-лигазы и поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы. За первый год работы над проектом мы посмотрели с помощью биохимических экспериментов взаимодействие этих «сенсоров» разрывов с системой CRISPR/Cas. Удивительно, но первые результаты показывают, что искусственная система очень успешно конкурирует с естественной.

Наше объяснение этих результатов: система CRISPR/Cas для эукариотических клеток не родная, природа их не готовила к взаимодействию с ней. Могу провести аналогию с биосинтезом белков: клетка очень точно включает в синтезируемый белок на рибосоме требуемую природную аминокислоту, замены никогда не происходит. Но стоит ввести в систему биосинтеза искусственный синтетический аналог аминокислоты, этот аналог включается в синтезируемый белок. Механизмы контроля не распознают неизвестного «пришельца». Сейчас нам эту гипотезу надо проверить в живых клетках. Более того, проведем сравнительный анализ: уже сделали клетки, в которых искусственно убрали определенные ник-сенсоры, – белки, распознающие разрыв ДНК. Посмотрим, отличается ли работа «молекулярных ножниц» в присутствии белков репарации и в случае их отсутствия. Достоверных данных об этом пока нет, хотя идея буквально лежит на поверхности. Поэтому, чтобы удержаться на передовых рубежах, надо работать быстро и эффективно.

Если мы и впрямь докажем, что клетка не опознает искусственную, хорошо работающую с ДНК систему CRISPR/Cas, это будет прекрасный вывод в плане перспектив геномного редактирования. Но точку в исследованиях ставить рано. Поскольку в этой системе есть РНК-проводники, надо изу-чить, как на геномное редактирование влияют различные РНК-связывающие белки.

– Дело в том, что геномное редактирование зависит от самих РНК-проводников, задающих его направленность, поэтому нам нужно создать алгоритм целевой модификации этих РНК-гидов, чтобы обеспечить максимально надежную и точную работу молекулярных машин геномного редактирования, – продолжает Дмитрий Пышный. – Это одна из задач, пока не проработанных в мировой науке. И поддержка Российского научного фонда здесь очень своевременна – нам удалось привлечь финансирование на то, чтобы проверить именно идеи. Причем идеи междисциплинарные. В рамках государственного задания, как правило, финансируются более традиционные направления. Но чтобы не отставать от мировой науки, нужны программы, позволяющие создать что-то для использования в реальном секторе экономики. В ходе реализации проекта мы ожидаем получить действительно новые инструменты для геномной инженерии, которые найдут применение и в медицине, и в биотехнологиях, и в сельском хозяйстве.

Ольга КОЛЕСОВА